Nach dem Tod Ferdinands I. 1564 entstand eine neue Linie des Hauses Habsburg: Erzherzog Karl, der jüngste Sohn Ferdinands, erhielt Innerösterreich zugesprochen, eine eigene Ländergruppe bestehend aus der Steiermark, Kärnten, Krain, Görz und den Gebieten an der nördlichen Adria mit Triest.

Die Hauptstadt dieses habsburgischen Teilreiches war Graz. Die alte landesfürstliche Residenz zu Füßen des Schlossberges, ein ursprünglich spätgotischer Palast aus der Zeit Friedrichs III. und Maximilians I., unter denen Graz bereits zeitweilig als kaiserliche Residenz diente, wurde von Karl weiter ausgebaut. Heute dient die Grazer Burg als Sitz der steirischen Landesregierung.

Die Hauptaufgabe der steirischen Linie war die Türkenabwehr. Um die Bedrohung bereits im Vorfeld abzuwehren, übernahm Innerösterreich die Finanzierung der Militärgrenze in Kroatien und Slawonien. Graz wurde zur militärischen und logistischen Kommandozentrale, von hier aus erfolgte die Verteilung von Proviant und Waffen. Eine Ahnung von den Dimensionen erhält man noch heute in der gewaltigen Waffensammlung im Zeughaus. Der Grazer Schlossberg wurde zur Hauptfestung ausgebaut. Die massiven Befestigungsanlagen mussten sich zwar niemals gegen die Türken bewähren, wurden jedoch von den Truppen Napoleons gesprengt – nur der Uhrturm blieb auf Initiative der Grazer bestehen.

Mit einem weiteren Konflikt war Karl im eigenem Land konfrontiert: Der Grazer Hof war eine katholische Enklave in einem überwiegend protestantischen Land, verfügte aber über beste Beziehungen zu katholischen Mächten. Eine wichtige Rolle spielte hier Karls bigotte Gattin Maria von Bayern aus dem Haus Wittelsbach, der katholischen Führungsmacht im Reich.

Karls Sohn und Nachfolger Ferdinand war durchdrungen von den Prinzipien des konfessionellen Absolutismus: ein Glaube, ein Herrscher. Als Regent über Innerösterreich setzte er ab 1590 diese Theorie nun in Realität um. Kompromisslos und gewaltsam wurde der Protestantismus ins Exil oder in den Untergrund gedrängt. So wurde zum Beispiel Johannes Kepler, der als Gelehrter in Diensten der protestantischen Stände stand, aus Graz ausgewiesen.

1619 wurde Ferdinand zum Oberhaupt der Dynastie, die steirische Nebenlinie der Habsburger zur Hauptlinie: Die kämpferische katholische Gegenreformation, die zunächst in Innerösterreich in kleinem Maßstab verwirklicht worden war, wurde nun auf die Gesamtmonarchie umgelegt. Ferdinand zog mit seinem Hof nach Wien, Graz verlor dadurch den Status einer Residenzstadt.

Nicht umsonst sind die sichtbarsten Zeichen habsburgischer Präsenz in Graz kirchliche Bauten. An Karl erinnert der gewaltige Komplex des Jesuitenkollegiums, die Keimzelle der 1585 gegründeten Grazer Universität. Bedeutendstes Monument ist das Mausoleum in Nachbarschaft zur ehemaligen Hofkirche, dem heutigen Dom. In diesem Hauptwerk des Manierismus in Österreich liegen die beiden habsburgischen Hauptfiguren der katholischen Gegenreformation, Ferdinand und seine Mutter Maria, begraben.