Mit Enea Silvio Piccolomini, dem späteren Humanistenpapst Pius II., drangen die Ideen des Humanismus – denen sich die Universität lange versperrt hatte – aus Italien auch nach Wien vor. Er begründete am Kaiserhof in Wiener Neustadt einen deutschen Humanistenkreis, der lateinische Klassiker las und einen urbanen Lebensstil pflegte.

An der Universität setzte sich die neue Geistesrichtung im 15. und frühen 16. Jahrhundert durch. Man widmete sich der Pflege antiker Wissenschaften und Künste, insbesondere der Übersetzung antiker Texte sowie der Mathematik und Astronomie.

Maximilian I. gründete 1501 an der Universität Wien ein eigenes Dichterkollegium, das „Collegium poetarum et mathematicorum“, unter dem Vorsitz des deutschen Humanisten Konrad Celtis (1459–1508). Die humanistische Gelehrtengesellschaft, die Celtis um sich scharte, stand in engem Kontakt zum kaiserlichen Hof. Das Kollegium umfasste Lehrkanzeln für Poetik, Rhetorik und Naturwissenschaften. Der Rektor des Dichterkollegs hatte das Recht zur Dichterkrönung, er konnte seinen Absolventen den Grad des „poeta laureatus“ verleihen. Später ging dieses Recht auf die Universität über. Kraft des kaiserlichen Privilegs konnte der Dekan der Philosophischen Fakultät bis ins 18. Jahrhundert an die Doktoren seiner Fakultät sogar Adel und Wappen verleihen.

Im Zuge der Reformation und der Türkenbelagerung ging die Lehr- und Forschungstätigkeit an der Universität zurück, sie verlor an Prestige und konnte sich erst durch die Reformen Kaiser Ferdinands I. 1554 wieder erholen. Diese Reformen brachten einerseits eine finanzielle Absicherung und mehr Lehrkanzeln mit sich. Andererseits nahmen nun die Landesfürsten größeren Einfluss, die Universität wurde staatlicher Kontrolle unterstellt.

In der Zeit der Gegenreformation wurden die Philosophische und die Theologische Fakultät den Jesuiten übertragen, welche auch die Professoren stellten. Sie verhalfen den Studien bald zu einem Aufschwung und errichteten ein neues Gebäude für die Universität (das Jesuitenkolleg) sowie eine Kirche.