Die Tochter von Kaiser Maximilian I. und Maria von Burgund wurde am französischen Hof erzogen. Mit 17 Jahren wurde sie mit dem spanischen Infanten Don Juan von Asturien verheiratet, der schon nach fünf Monaten verstarb. 1500 ging sie in die Niederlande und heiratete erneut, doch auch der zweite Gemahl starb bald. Ihr Vater ernannte sie 1507 zur Regentin der Niederlande, wo sie vor allem die Künste förderte.